Flux de travail du gradient à la section CUBE pour la génération et l'imagerie d'organoïdes avec différenciation localisée

Biologie des communications volume 6, Numéro d'article : 299 (2023) Citer cet article

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Les progrès dans la culture organoïde ont conduit à la création de divers mini-organes in vitro qui imitent les tissus natifs de plusieurs manières. Pourtant, le goulot d’étranglement reste la génération d’organoïdes complexes avec une configuration des axes corporels, ainsi que le maintien de l’orientation des organoïdes pendant les processus d’analyse post-expérience. Ici, nous présentons un flux de travail pour la culture d’organoïdes avec gradient morphogène à l’aide d’un dispositif de culture CUBE, suivi de la section d’échantillons avec le CUBE pour conserver des informations sur la direction du gradient. Nous montrons que les sphéroïdes hiPSC cultivés avec deux milieux de différenciation séparés aux extrémités opposées du CUBE ont abouti à des expressions localisées des marqueurs de différenciation respectifs, contrairement à la distribution homogène des marqueurs chez les contrôles. Nous décrivons également les processus de coupe cryogénique et paraffine des sphéroïdes dans CUBE afin de conserver les informations d’orientation du gradient. Ce flux de travail, de la culture en gradient à la coupe avec CUBE, peut fournir aux chercheurs un outil pratique pour générer des organoïdes de plus en plus complexes et étudier leurs processus de développement in vitro.

Les cellules souches pluripotentes (CSP) et les organoïdes qui en dérivent offrent un moyen pragmatique de modéliser et d'étudier la formation de tissus et d'organes au début du développement humain, car les spécimens réels posent des problèmes éthiques difficiles1,2,3,4. Les protocoles pour générer les différents organoïdes qui imitent les tissus natifs reposent généralement sur la manipulation séquentielle de l'activation ou de l'inhibition de voies de signalisation telles que Nodal, Hedgehog, Notch, Wnt ou BMP à différents moments pour induire une différenciation vers des lignées spécifiques, comme dans le génération d’organoïdes intestinaux5, rénaux6 et pulmonaires7, d’épiblastes8,9 et de gastruloïdes10.

Néanmoins, contrôler la croissance et la différenciation des cellules le long d’un axe corporel reste un défi dans les cultures organoïdes 3D. In vitro, la structuration antéro-postérieure et dorso-ventrale des organoïdes peut résulter de l'auto-organisation cellulaire11,12, ou obtenue en fusionnant des organoïdes différenciés séparément en tant qu'assembloïde, comme dans les organoïdes cérébraux avec différentes régions du cerveau ou les organoïdes biliaires avec le foie, les voies biliaires. composants des voies respiratoires et du pancréas13,14. La limitation de ces méthodes, cependant, est que, comme les cellules sont cultivées dans un seul milieu uniforme, le niveau de contrôle en termes d’informations spatiales fournies aux cellules est assez faible ; toutes les cellules du groupe de cellules qui composent l'organoïde reçoivent les mêmes signaux de différenciation de la part des molécules de signalisation présentes dans le milieu. In vivo, d'autre part, les gradients de concentration de morphogènes provenant d'autres sources contribuent également à déterminer où vont les cellules et quel phénotype ou modèle elles doivent adopter au cours du développement15,16. Par exemple, la formation du tube neural dépend des signaux provenant de la notocorde et de la couche non neurale de l'ectoderme17, et les néphrons du rein se développent par échange de divers signaux entre le bourgeon urétéral et le mésenchyme métanéphrique18. Ainsi, il est nécessaire de reproduire les gradients morphogènes afin de générer des organoïdes qui ressemblent davantage aux tissus natifs in vivo.

Plusieurs technologies d'ingénierie ont été développées pour imiter la fourniture d'un gradient spatial de molécules de signalisation aux cellules in vitro. Les CSP conçues pour exprimer Sonic Hedgehog (Shh)19 ou des billes d'agarose imbibées de morphogènes20 peuvent être placées à proximité de l'organoïde en développement et la diffusion de molécules de la source vers les cellules en différenciation a créé un gradient de concentration élevé à faible de morphogènes. De plus, divers transwells et microdispositifs modifiés permettant de cultiver des cellules avec deux compartiments de milieu distincts ont également été développés pour générer des gradients de morphogène dans des directions opposées à travers les cellules21,22,23,24,25,26. Cependant, ces technologies ne sont pas sans inconvénients : (1) elles nécessitent des procédures de préparation et de configuration compliquées qui ne sont pas faciles à réaliser dans la plupart des laboratoires de biologie sans compétences et équipements spécialisés, (2) elles manquent de contrôle sur le placement et le positionnement des échantillon dans le dispositif, et (3) il est difficile de récupérer l'échantillon du dispositif après l'expérience pour des analyses plus approfondies sans causer beaucoup de dommages à l'échantillon ou sans perdre l'orientation de l'échantillon. En particulier, la capacité de conserver des informations sur l’orientation du gradient auquel les cellules étaient soumises est essentielle pour garantir une analyse correcte de l’échantillon.